与蛋白组学方法不同，ABPP（Activity-Based Protein Profiling）不仅能识别蛋白的表达，还能捕捉其“活性状态”，尤其适用于如蛋白酶、磷酸酶、脱酰化酶等调控复杂的功能蛋白。那么，如何系统地开展一次完整的ABPP实验？从探针选择到质谱分析，从样本处理到数据解读，本文将一步步带你拆解ABPP实验的完整流程，为你的研究提供清晰、高效的操作指南。

一、ABPP实验的完整流程

1、确定研究目标与酶类家族

开展ABPP实验的第一步是明确研究目标：你希望分析哪类酶？在哪种生物模型或处理条件下进行？常见的目标包括：

（1）筛选肿瘤中活性异常的蛋白酶

（2）验证候选药物对目标酶的作用

（3）分析炎症或凋亡信号通路中活性酶的调控模式

不同的酶类需要设计或选择特异性的ABP（Activity-Based Probe），因此目标酶的确定决定了后续的探针策略和数据分析路径。

2、选择或定制活性探针（ABP）

ABP 是 ABPP 成功的关键工具，结构上一般由以下三部分组成：

3、探针标记ABPP实验样本

标记实验的执行步骤主要分为两种模式：

（1）细胞裂解液标记（in vitro）

* 提取细胞/组织蛋白，保持酶活性

• 与探针混合孵育（30–60 min）
• 终止反应并进行下游处理

适用于酶筛选或药物作用机制研究。

（2）活细胞或组织标记（in situ/in vivo）

* 直接在活细胞中添加探针

• 反应完成后快速裂解
• 捕获在原位状态下的酶活性图谱

更接近生理状态，但需注意探针通透性和毒性。

4、富集与酶解

标记完成后，下一步是将被标记的“活性酶”从复杂背景中富集出来：

（1）若使用生物素标记 → 使用链霉亲和磁珠进行亲和纯化

（2）若使用点击基团 → 进行点击反应后连接到富集载体（如Biotin-Azide）

富集完成后，用胰蛋白酶（Trypsin）等进行标准蛋白酶解反应，为后续质谱检测准备肽段。

5、质谱检测（LC-MS/MS）

样本准备好后，进入高分辨率质谱分析阶段。建议使用如下策略：

（1）仪器平台：如Orbitrap Exploris 480，适合高通量、高精度需求

（2）分离方式：纳升级反相色谱（nanoLC）可提升肽段分离能力

（3）检测模式：可选择DDA（数据依赖采集）或DIA（数据独立采集）

（4）定量方法：支持Label-Free、TMT、iTRAQ等多种定量策略

此阶段获取的ABPP实验原始数据为后续构建活性图谱提供核心信息。

6、数据分析与活性谱图绘制

ABPP的最终目标是生成一份活性蛋白图谱。数据分析流程主要包括：

（1）肽段鉴定与定量

利用专业软件（如MaxQuant、Proteome Discoverer）进行肽段识别、定量。

（2）特异性筛选

只保留已成功标记（被探针捕获）的蛋白，去除背景信号。

（3）活性变化分析

比较不同处理组（如药物处理 vs 对照）的酶类活性水平差异，常用log2 fold change + FDR筛选。

（4）功能注释与通路富集

结合GO、KEGG、Reactome数据库，对高活性或差异酶类进行功能分类与通路分析，提炼生物学意义。

（5）图谱展示

输出蛋白酶活性热图、分子互作网络、通路富集图等，辅助撰写论文或申请专利。

二、常见问题解答（FAQ）

Q1：ABPP实验可用于哪类蛋白？ 主要用于具有活性位点、可被探针共价修饰的酶类蛋白，如蛋白酶、磷酸酶、泛素化酶等。

Q2：探针非特异性如何解决？ 可通过空白组+竞争抑制组进行背景去除，并优化探针浓度与反应时间。

Q3：数据重复性如何保证？ 推荐进行≥3次生物学重复，同时采用TMT等方法减少批次效应。

三、百泰派克生物科技：ABPP全流程一站式服务平台

为降低ABPP实验的技术门槛、提升实验成功率，百泰派克生物科技提供以下服务：

1、多种活性探针筛选与合成（支持定制化设计）

2、全流程实验操作（从样本处理到富集酶解）

3、高分辨质谱检测与分析

4、差异蛋白活性分析、通路注释与图谱输出

借助先进的Orbitrap平台和功能蛋白组学分析体系，百泰派克助力您高效完成从活性识别到靶点挖掘的科学探索。

ABPP的价值在于，它不仅揭示蛋白的“在”与“不在”，更回答“活着的，正在起作用的，是谁”。掌握ABPP，不仅是掌握一种技术，更是打开了理解蛋白质功能状态和精准靶点发现的大门。欢迎联系百泰派克生物科技，获取ABPP实验流程的专业培训与项目支持，助您从表达组跨越到功能组！

百泰派克生物科技特色项目

一、蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 100% 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

二、蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.专业生物信息学分析，分析更系统准确。

三、单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，然后用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，最后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标同时进行表征，百泰派克生物科技可做到同时检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从最小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

五、生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

百泰派克生物科技七大检测平台

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物质谱多组学优质服务商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于为生物/制药和医疗器械行业提供质量控制检测和项目验证等专业服务。公司实验室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法规和指导原则，通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，建立了完备的质量体系，数据冷热/异地备份，设备定期计量/期间核查，软件审计追踪，为客户提供一体化解决方案和技术服务，支持新药研发、药物申报注册和生产放行。

1.公司采用ISO9001质量控制体系，专业提供以质谱为基础的CRO检测分析服务；

2.获国家CNAS实验室认可，为客户提供符合全球药政法规的药物质量研究服务；

3.业务范围覆盖蛋白质组学、多肽组学、代谢组学、生物药物表征、单细胞分析、单细胞质谱流式、生信云分析以及多组学生物质谱整合分析等；

4.七大质量控制检测平台，满足您一站式服务需求；

5.服务3000+企业，10000+客户的选择；

6.致力于为您提供优质的生物质谱分析服务!

>>点击了解更多优质服务项目